Team name

合成一下

CD40L-binding proteinsde novo design with RFdiffusion以 CD40L 为靶点，从头设计蛋白结合剂，并用 SPR 测到最高 2.77 nM 的亲和力

厦门大学化学化工学院T1 医药健康

Project title

CD40L-binding proteinsde novo design with RFdiffusion

T1 医药健康CD40LELISA + SPR

厦门大学「合成一下」使用 RFdiffusion 生成骨架、ProteinMPNN 反译序列，筛出五条候选蛋白并以 SPR 复核亲和力。

Team name: 合成一下
Institution: 厦门大学化学化工学院

免疫系统是人体抵御疾病的重要防线，而其中蛋白质之间的相互作用对免疫调控发挥着关键作用。项目目标是设计能够特异性结合 CD40L 的新型蛋白分子。改造已有抗体依赖已知模板，从头设计则需要直接建立新的结合结构。RFdiffusion 等生成模型使无天然模板的候选蛋白骨架设计成为可执行方案。

研究路径

计算生成与结构筛选

第一步使用 RFdiffusion 生成约两千个初始蛋白骨架，仅确定候选结构。第二步使用 ProteinMPNN 为每个骨架反译 5 条候选序列。该步骤从目标折叠反推可形成相应结构的氨基酸序列。第三步使用 AlphaFold2 与 Rosetta 复核结构合理性和结合界面稳定性。复核同时评估候选序列的折叠一致性与 CD40L 结合界面能量。生成、序列设计与结构复核构成相互校验的从头蛋白设计流程。

靶点: CD40L
最优亲和力: KD 2.77 nM
候选: JFL1–JFL5

蛋白设计计算工作站工作站屏幕展示蛋白结构与分析界面，计算端据此检查候选结合蛋白。

01
阶段 1
候选制备与亲和力验证
SPR 传感图上并排三条曲线，对应候选 JFL2、JFL4、JFL5，JFL2（31.5 nM）和 JFL5（2.77 nM）达到高亲和力水平，JFL4（144 nM）表现为中等亲和力。作为参照，一般认为 KD < 100 nM 可视为较高亲和力，KD < 10 nM 通常属于超高亲和力。按上述标准，JFL5 的 2.77 nM 属于超高亲和力范围。此外完成了分子动力学模拟，用 RMSD、RMSF、Rg、SASA、氢键等指标评价复合物的构象稳定性。
02
阶段 2
计算设计流程贯通
前期调试围绕 RFdiffusion 参数和 ProteinMPNN 序列选择展开。计算链路包括从生成骨架，到 MPNN 反译序列，再到结构预测与 Rosetta 的层层筛选，最后筛得高潜力候选蛋白。

蛋白实验操作队员在实验设备前完成样品操作，记录候选蛋白进入表达与检测环节的现场。

ELISA 初筛结果图中给出 BSA 与 CD40L 标准曲线，并比较候选结合蛋白的浓度响应关系与 EC50。

候选结构分析成员在工作站前查看结构与数据结果，为候选蛋白的后续验证整理依据。

复合物 RMSD 轨迹四组轨迹记录候选复合物在 200 ns 分子动力学模拟中的骨架位移变化。

计算设计筛选流程流程从 CD40L 界面定义和 RFdiffusion 骨架生成出发，经序列设计、结构预测与界面分析筛选候选。

合成一下

CD40L-binding proteinsde novo design with RFdiffusion

CD40L 靶点与从头蛋白设计

计算生成与结构筛选

项目推进与验证路径

候选制备与亲和力验证

计算设计流程贯通

项目图表与方法记录

计算、实验与候选复核记录